Metodo di amplificazione:
PCR a fluorescenza isotermica: Nella PCR a fluorescenza isotermica, l'amplificazione del DNA avviene a temperatura costante. Ciò significa che la reazione avviene ad un'unica temperatura costante durante l'intero processo.
PCR in tempo reale: la PCR in tempo reale, nota anche come PCR quantitativa (qPCR), utilizza un processo di ciclo termico. Implica più cicli di temperatura, comprese le fasi di denaturazione, ricottura ed estensione. Questi cicli di temperatura sono generalmente controllati da una macchina termociclatrice.
Controllo della temperatura:
PCR a fluorescenza isotermica: come suggerisce il nome, la PCR a fluorescenza isotermica mantiene una temperatura costante durante la reazione, tipicamente intorno a 60-65 ℃. Ciò semplifica l'attrezzatura necessaria per la reazione rispetto alla PCR in tempo reale.
PCR in tempo reale: la PCR in tempo reale prevede un ciclo termico, in cui la temperatura viene modificata ripetutamente tra diversi livelli (ad esempio, denaturazione a circa 95 ℃, ricottura a circa 55-65 ℃ ed estensione a circa 72 ℃). Ciò richiede un termociclatore con un controllo preciso della temperatura.
Metodo di rilevamento:
PCR a fluorescenza isotermica: il rilevamento della fluorescenza viene utilizzato sia nella PCR a fluorescenza isotermica che nella PCR in tempo reale. Tuttavia, nella PCR a fluorescenza isotermica, i segnali di fluorescenza vengono generalmente rilevati in modo continuo senza la necessità di alternare ciclicamente tra diversi passaggi di temperatura.
PCR in tempo reale: nella PCR in tempo reale, i segnali di fluorescenza vengono misurati dopo ogni ciclo di variazione della temperatura (tipicamente dopo la fase di ricottura/estensione). Ciò consente il monitoraggio in tempo reale dell'amplificazione del DNA mentre avviene durante il processo di ciclo termico.
Applicazioni:
PCR a fluorescenza isotermica: questa tecnica è adatta per alcune applicazioni, come i test rapidi presso il punto di cura, dove semplicità e velocità sono essenziali. Può essere utilizzato per il rilevamento qualitativo di specifiche sequenze di DNA.
PCR in tempo reale: La PCR in tempo reale è ampiamente utilizzata per l'analisi sia qualitativa che quantitativa del DNA. È altamente sensibile e consente la misurazione della quantità iniziale di DNA in un campione, rendendolo utile per applicazioni come l'analisi dell'espressione genica, la quantificazione della carica virale e la genotipizzazione.
In sintesi, la principale differenza tra la PCR a fluorescenza isotermica e la PCR in tempo reale è il metodo di controllo della temperatura e di amplificazione. La PCR a fluorescenza isotermica mantiene una temperatura costante durante tutta la reazione ed è adatta per applicazioni più semplici e rapide, mentre la PCR in tempo reale prevede cicli termici e viene utilizzata per un'ampia gamma di applicazioni di analisi del DNA quantitative e qualitative.
