La sterilizzazione del serbatoio reale (sterilizzazione reale) è un processo di sterilizzazione in cui tutto il terreno di coltura preparato viene immesso in un bioreattore-fermentatore o altro dispositivo, viene introdotto vapore per riscaldare il mezzo di coltura e l'attrezzatura utilizzata alla temperatura di sterilizzazione, mantenuta per un certo periodo di tempo e quindi raffreddata alla temperatura di inoculazione, come mostrato nella Figura 1.
Figura 1 Diagramma schematico dell'effettiva eliminazione
Questo processo è anche chiamato sterilizzazione intermittente o sterilizzazione batch (rispetto alla sterilizzazione continua).
L'operazione di sterilizzazione a serbatoio pieno comprende in realtà tre processi: riscaldamento, conservazione del calore e raffreddamento. La Figura 2 mostra le variazioni di temperatura durante la sterilizzazione a serbatoio pieno del terreno di coltura.
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Figura 2 Variazioni di temperatura durante la sterilizzazione della lattina
Passaggi specifici per la sterilizzazione delle lattine:
1. Ispezione pulizia vasca
Prima della pulizia, verificare se lo stato della valvola è corretto. Durante la pulizia, prestare attenzione a verificare se vi sono perdite nell'apparecchiatura e nelle tubazioni, principalmente nelle tubazioni di raffreddamento.
Controllare se l'acqua di condensa nella camicia del fermentatore è stata scaricata per garantire che non ci sia acqua di raffreddamento nella camicia del fermentatore.
Dopo la pulizia controllare l'interno del serbatoio per vedere il colore originale senza sporco evidente.
2. Preparazione prima della sterilizzazione
Sterilizzare il filtro dell'aria del fermentatore e asciugarlo con aria sterile.
Controllare per assicurarsi che il serbatoio sia depressurizzato. Inserire l'elettrodo pulito e calibrato nel serbatoio e collegare il filo dell'elettrodo. Verificare che la valvola di fondo del serbatoio sia chiusa
Quindi aggiungere i materiali preparati nel serbatoio, aggiungere l'acqua necessaria per compensare il volume in base ai requisiti del processo, aggiungere l'antischiuma e controllare se manca del materiale. Al termine, mescolare per evitare che il liquido si depositi.
3. Riscaldamento
(1) Riscaldamento indiretto
Aprire le valvole di scarico del corpo del serbatoio, contemporaneamente, chiudere l'acqua di raffreddamento della camicia, aprire la valvola del vapore della camicia o della bobina, introdurre vapore nella camicia o nella bobina per riscaldare indirettamente il liquido, aprire leggermente lo scarico del tubo di ingresso dell'acqua della camicia valvola e scaricare l'acqua di condensa nel corpo e nel rivestimento del serbatoio.
Quando la temperatura del serbatoio sale a 80-90℃, chiudere gradualmente la valvola di scarico.
Il ruolo del preriscaldamento del vapore della camicia:
①Ridurre la generazione di acqua di condensa e garantire l'accuratezza del volume del terreno di coltura dopo la disinfezione.
All'inizio, il vapore viene introdotto direttamente nel serbatoio e il materiale freddo nel serbatoio viene immesso direttamente nel vapore, il che molto probabilmente produrrà una grande quantità di acqua condensata e renderà il volume del terreno di coltura troppo grande dopo il consumo . Alcune fabbriche omettono questo passaggio e devono controllare la quantità di acqua condensata generata attraverso esperimenti per garantire la concentrazione del mezzo di coltura.
②Ridurre il rumore.
La differenza di temperatura tra il materiale e il vapore è troppo grande e l'introduzione diretta del vapore causerà vibrazioni nell'apparecchiatura.
③ Favorisce la gelatinizzazione e la liquefazione delle materie prime amidacee. (Ciò non si applica alle materie prime senza amido)
La temperatura della camicia aumenta in modo relativamente lento, il che è vantaggioso per la completa dissoluzione dei materiali che potrebbero non essere completamente disciolti nel mezzo di coltura per materiali amidacei ed evita la gelatinizzazione e l'agglomerazione della superficie del materiale causata da un aumento di temperatura troppo rapido, che influenza l'effetto di sterilizzazione.
(2) Riscaldamento diretto
Dopo aver preriscaldato la camicia a 80-90 ℃ , chiudere la valvola di ingresso del vapore della camicia (può anche essere chiusa), aprire la valvola di ingresso del vapore del serbatoio e consentire al vapore di fluire direttamente nel serbatoio per aumentare la temperatura del serbatoio a 118-121 ℃ . Aprire varie valvole di scarico e smettere di mescolare.
4. Isolamento termico e pressione
Quando la temperatura del materiale è vicina alla temperatura specificata dal processo, ridurre gradualmente la valvola del vapore e regolare il bilanciamento di ciascuna valvola per fare in modo che la pressione e la temperatura raggiungano costantemente la pressione e la temperatura richieste dal processo (generalmente leggermente superiore alla temperatura della coltura di 0,5-2℃, altrimenti scenderà troppo).
In questo momento, tutti i tubi collegati al reattore devono essere in due stati: ingresso vapore o uscita vapore, per poter sterilizzare i tubi.
Durante la fase di isolamento, il vapore dovrebbe essere immesso in tutte le tubazioni al di sotto del livello del liquido del mezzo di coltura; il vapore deve essere scaricato da altri tubi al di sopra del livello del liquido, in modo da garantire una sterilizzazione completa senza angoli morti. L'isolamento è generalmente di 121 ℃ per 25-30 minuti.
di fermentazione generali hanno generalmente tre aperture (tubo di ingresso dell'aria, tubo di scarico e tubo di campionamento) per l'aspirazione del vapore, che è la cosiddetta "ingresso del vapore a tre vie".
Per "uscita vapore a quattro vie" si intende che il vapore viene scaricato direttamente dai tubi di scarico, inoculazione, alimentazione e antischiuma. Principalmente in questi quattro modi, è necessario aprire anche le valvole di ingresso e uscita del vapore.
5. Colaggio
Dopo la sterilizzazione, chiudere innanzitutto tutte le valvole di ingresso del vapore e ridurre leggermente la valvola di scarico. Quindi, aprire la valvola di ingresso dell'aria per far entrare aria sterile e mantenere la pressione del serbatoio. Va notato che la pressione nel serbatoio dovrebbe essere inferiore alla pressione del filtro dell'aria per evitare il riflusso del mezzo di coltura.
Infine, aprire la valvola dell'acqua di raffreddamento e far passare l'acqua fredda attraverso la camicia o la serpentina per un raffreddamento rapido, iniziare a mescolare e raffreddare il terreno di coltura alla temperatura richiesta dal processo di fermentazione .
Dopo la sterilizzazione, è necessario introdurre aria sterile in tempo per garantire la pressione all'interno del serbatoio (generalmente la pressione del serbatoio viene regolata su 0,1 MPa) prima che venga aggiunta acqua di raffreddamento per il raffreddamento.
La funzione dell'introduzione di aria sterile è quella di accelerare il raffreddamento e mantenere la pressione positiva nel serbatoio, per evitare che il raffreddamento del mezzo di coltura formi una pressione negativa nel serbatoio, che può essere facilmente infettata da batteri o causare il bioreattore. fermentatore sia danneggiato (la pressione del serbatoio del bioreattore-fermentatore scende a zero e il corpo del serbatoio viene aspirato in piano). Questo è un incidente che si verifica spesso durante l'operazione di sterilizzazione di serbatoi di fermentazione rivestiti in acciaio inossidabile . Si tratta di un grave incidente di produzione.
Per giudicare la qualità della sterilizzazione dei serbatoi dei terreni di coltura vengono utilizzati i seguenti quattro criteri:
① Soddisfare i requisiti di sterilità dopo la sterilizzazione;
②Minore distruzione dei nutrienti;
③ Il volume del terreno di coltura dopo la sterilizzazione è coerente con il volume del mangime;
④Meno schiuma.
Durante il processo di sterilizzazione è necessario prestare attenzione a diversi aspetti:
(1) Il ruolo dell'agitazione della sterilizzazione
Nella sterilizzazione a contenitore pieno, l'agitazione gioca un ruolo molto importante.
Lo scopo dell'attivazione dell'agitazione:
① Rendere i materiali sterilizzati riscaldati e trasferiti uniformemente per evitare la formazione di false pressioni durante il processo di sterilizzazione della lattina;
② Evitare la sedimentazione del materiale. Una volta che si verificano la sedimentazione e la stratificazione, ciò causerà una temperatura di riscaldamento incoerente e genererà facilmente una falsa pressione.
(2) Variazioni del volume del liquido dopo la sterilizzazione
Quando si prepara il terreno di coltura, è necessario prestare la massima attenzione all'aumento di volume del terreno di coltura dopo la sterilizzazione.
Più lungo è il tempo di sterilizzazione, più aumenta il volume. Più bassa è la temperatura, maggiore è il volume di vapore in entrata, che generalmente aumenta di circa il 10%, in relazione alla qualità del vapore.
La camicia non è preriscaldata o preriscaldata in modo insufficiente, l'acqua di condensa nel tubo del vapore non è completamente scaricata, il vapore inviato dal locale caldaia contiene troppa acqua, ecc., che formerà molta acqua di condensa e aumenterà il volume.
(3) Considerazione del tempo di sterilizzazione della confezione
Nella produzione di fermentazione industriale , la fase di conservazione del calore è solitamente considerata come il tempo di sterilizzazione. Ora vengono generalmente utilizzati 121 ℃ e 30 minuti.
Tuttavia, il tempo di mantenimento della sterilizzazione richiesto per ottenere lo stesso effetto di sterilizzazione in fermentatori di dimensioni diverse è teoricamente diverso.
I 40m3 il bioreattore-fermentatore è sterilizzato e il tempo teorico di sterilizzazione è calcolato dalla formula
Figura 4 Calcolare il tempo teorico di sterilizzazione.
t——indica il tempo teorico di sterilizzazione, s;
N0——il numero originale di batteri vitali all'inizio della sterilizzazione (t=0), cellule/mL;
Nt——Numero di batteri viventi rimanenti dopo il tempo t, cellule/mL;
k——costante del tasso di morte batterica, s-1, che è correlata al tipo di microrganismo e alla temperatura.
Supponiamo che il terreno di coltura contenga 2×107 spore di batteri resistenti al calore/mL e che la costante di velocità di sterilizzazione a 121 ℃ sia 0,0287s-1.
Il tempo necessario per ottenere una probabilità di fallimento della sterilizzazione pari a 0,001 è di 23,9 minuti. L'effetto di sterilizzazione delle due fasi del terreno di coltura che sale dalla temperatura ambiente a 121 ℃ e scende da 121 ℃ alla temperatura di coltura di fermentazione non viene preso in considerazione in questo caso.
In effetti, il riscaldamento e l'aumento della temperatura contribuiscono alla sterilizzazione del mezzo di coltura, soprattutto quando il mezzo di coltura viene riscaldato oltre i 100 ℃ , questo effetto è più evidente.
Se si tiene conto dell'effetto di sterilizzazione del terreno di coltura durante la fase di riscaldamento e se sono necessari 15 minuti per aumentare la temperatura del terreno di coltura da 100 ℃ a 121 ℃ , il tempo di sterilizzazione durante la fase di isolamento viene calcolato in 21,1 minuti e il tempo di isolamento viene ridotto del 12%.
Maggiore è il volume del serbatoio di fermentazione , più lungo sarà il tempo di riscaldamento per la sterilizzazione del serbatoio, maggiore sarà l'impatto della fase di riscaldamento sulla sterilizzazione e più breve sarà il corrispondente tempo di isolamento.
I piccoli serbatoi si riscaldano rapidamente e il tempo di riscaldamento può essere ignorato. I serbatoi di fermentazione attualmente utilizzati nell'industria della fermentazione sono relativamente grandi (60-100 m3) e si dovrebbe considerare l'effetto di sterilizzazione durante la fase di riscaldamento per ridurre al minimo la distruzione dei nutrienti.
Per i serbatoi di fermentazione con un volume inferiore a 40 m3, questo effetto può essere ignorato.
Inoltre, anche la fase di raffreddamento contribuisce in una certa misura alla sterilizzazione, ma oggigiorno sono comunemente utilizzate misure di raffreddamento rapido, che sono di breve durata e generalmente non vengono prese in considerazione nei calcoli.
